Javascript ist derzeit in Ihrem Browser deaktiviert.Mehrere Funktionen dieser Website funktionieren nicht, wenn Javascript deaktiviert ist.freier Zugang zu wissenschaftlicher und medizinischer ForschungVon der Einreichung bis zur ersten redaktionellen Entscheidung.Von der redaktionellen Abnahme bis zur Veröffentlichung.Der oben genannte Prozentsatz an Manuskripten wurde in den letzten 12 Monaten abgelehnt.Peer-reviewte wissenschaftliche und medizinische Open-Access-Zeitschriften.Dove Medical Press ist Mitglied des OAI.Massennachdrucke für die pharmazeutische Industrie.Wir bieten unseren Autoren echte Vorteile, einschließlich einer beschleunigten Bearbeitung von Papieren.Registrieren Sie Ihre spezifischen Daten und spezifischen Arzneimittel von Interesse und wir gleichen die von Ihnen bereitgestellten Informationen mit Artikeln aus unserer umfangreichen Datenbank ab und senden Ihnen umgehend PDF-Kopien per E-Mail zu.Zurück zu Zeitschriften » International Journal of Nanomedicine » Volume 11Veröffentlicht am 8. April 2016 Band 2016:11 Seiten 1461–1473DOI https://doi.org/10.2147/IJN.S101955Begutachtung durch einmaliges anonymes Peer-ReviewHerausgeber, der die Veröffentlichung genehmigt hat: Dr. Thomas J. WebsterVenu Kesireddy1,2 1Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest University Baptist Medical Center, Winston Salem, NC, USA;2Center for Craniofacial Research, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center at Houston, Houston, TX, USA Zusammenfassung: Volumetrischer Muskelverlust (VML) kann durch angeborene Defekte, Muskelschwundkrankheiten, zivile oder militärische Verletzungen und als Folge auftreten der chirurgischen Entfernung von Muskelgewebe (z. B. Krebs), die alle zu unwiderruflichen funktionellen und kosmetischen Defekten führen können.Gegenwärtige Tissue-Engineering-Strategien zur Reparatur von VML verwenden häufig muskelabgeleitete Vorläuferzellen (MDCs) als eine Komponente.Es gibt jedoch einige inhärente Beschränkungen bei ihrer Expansion in vitro-Kulturen.Daher untersucht diese Studie das Potenzial von aus Fett gewonnenen Stammzellen (ADSCs) als alternative Zellquelle zu MDCs für das Tissue Engineering von Skelettmuskeln.Ein reproduzierbares VML-Verletzungsmodell im murinen Latissimus dorsi-Muskel wurde verwendet, um Tissue-Engineered Muscle Repair (TEMR)-Konstrukte zu bewerten, die MDCs oder ADSCs enthalten.Wichtig ist, dass die histologische Analyse ergab, dass ADSC-besiedelte Konstrukte ein Regenerationspotenzial aufwiesen, das 2 Monate nach der Reparatur mit denen vergleichbar war, die mit MDCs besät wurden.Darüber hinaus zeigte die morphologische Analyse der gewonnenen Konstrukte Anzeichen einer Neogewebebildung, einschließlich Zellfusion, Faserbildung und Gerüstumbau.Die Immunhistochemie zeigte eine positive Färbung sowohl für strukturelle als auch funktionelle Proteine.Eine positive Färbung für vaskuläre Strukturen wies auf das Potenzial für ein langfristiges Überleben des Neogewebes und eine Integration in die vorhandene Muskulatur hin.Die qualitative Beobachtung von Lentivirus-Cherry-markierten Spenderzellen durch Immunhistochemie zeigt, dass die Beteiligung von ADSCs an der Bildung neuer hybrider Myofasern, die Spenderzellen enthalten, im Vergleich zu Spender-MDCs relativ gering war.ADSCs scheinen jedoch an der Vaskularisierung beteiligt zu sein.Zusammenfassend habe ich gezeigt, dass TEMR-Konstrukte, die mit ADSCs generiert wurden, ein Skelettmuskelregenerationspotenzial zeigten, das mit TEMR-MDC-Konstrukten vergleichbar war, wie zuvor berichtet.Schlüsselwörter: Skelettmuskelregeneration, muskelabgeleitete Vorläuferzellen, Immunmodulation, parakrine SignalübertragungObwohl die Regeneration im gesamten Tierreich stattfindet, gibt es große Unterschiede im Grad der inhärenten Regenerationsfähigkeit nicht nur zwischen den Arten, sondern auch zwischen den Gewebetypen.1,2 Das Gebiet der regenerativen Medizin versucht, den Regenerationsprozess bei einer Vielzahl von Menschen zu ergänzen oder zu ermöglichen Gewebe und kompensiert dadurch die Einschränkungen, die dem Selbstheilungspotenzial vieler kritischer Organe und Systeme innewohnen.3 Obwohl Skelettmuskeln eine ziemlich bemerkenswerte Fähigkeit zur Selbstregeneration als Reaktion auf kleinere Verletzungen4,5 Krankheiten, angeborene Defekte und chirurgische Nebenwirkungen besitzen , und Trauma können alle zu dauerhaften Defekten im Aussehen und, was noch wichtiger ist, in der Funktion der Skelettmuskulatur führen.6,7 Defizite in dieser Kategorie, bekannt als volumetrischer Muskelverlust (VML),8 können nicht mit bestehenden Therapien, einschließlich chirurgischer Reparatur, behoben werden mit Lappenplastiken9 und physikalischer Therapie.8 Daher wären Technologien der regenerativen Medizin zur Behandlung dieser Verletzungen von großem Wert, wie die aktuelleDer Behandlungsstandard für VML-Verletzungen ist äußerst schlecht.Zu den derzeit in der Entwicklung befindlichen Ansätzen in dieser Richtung gehören solche, die ein azelluläres Gerüst,10,11 Stamm- oder Vorläuferzellen12–15 oder eine Kombination aus beidem verwenden.16–18 Mehrere Gruppen haben über eine variable Neogewebebildung und funktionelle Wiederherstellung bei Skelettmuskelverletzungen durch Verwendung berichtet von entweder aus Satellitenzellen stammenden Muskelvorläuferzellen19 oder mesenchymalen Stammzellen (MSCs).20–23 Im Gegensatz zu diesen Ansätzen konzentrierten sich neuere Berichte16,17 auf die Reparatur von VML-Verletzungen mit TEMR-Konstrukten (Tissue-Engineering Muscle Repair), die durch Seeding-Muskel erzeugt wurden -derived progenitor cells (MDCs) auf Gerüsten der azellulären Matrix der Blase (BAM) und deren In-vitro-Differenzierung und Reifung in einem Bioreaktor.Obwohl diese Studien den Nutzen von TEMR für die Behandlung von VML-Verletzungen in plattenbasierten Muskeln wie Latissimus dorsi (LD) bei Nagetieren elegant demonstrierten,16 bleiben noch einige Hindernisse für die Skalierung der Technologie für eine erfolgreiche Anwendung von TEMR-Konstrukten bei großen Verletzungen beim Menschen, insbesondere komplexe traumatische Verletzungen, die sowohl auf als auch außerhalb des Schlachtfeldes erlitten wurden.VML-Verletzungen führen häufig nicht nur zum Verlust von Muskelgewebe, sondern auch der unterstützenden Infrastruktur wie begleitenden Blutgefäßen und Nervenverbindungen.8 Es ist denkbar, dass zur Rekonstruktion solch großer Verletzungen eine weitaus größere Anzahl von Muskelstamm- und Vorläuferzellen erforderlich ist.Aufgrund der begrenzten Größe von Biopsien, die für die Isolierung von Muskelvorläuferzellen verwendet werden können, besteht jedoch ein erheblicher Bedarf an einer In-vitro-Kulturexpansion.Das Problem wird weiter verschärft durch die Schwierigkeit, die der Kulturexpansion von Muskel-Vorläuferzellen innewohnt, während gleichzeitig ihr myogener Phänotyp beibehalten wird.24,25Stammzellen bieten eine attraktive Alternative.Bis heute wurde eine Vielzahl von Stammzelltypen in Muskelreparaturanwendungen untersucht, darunter embryonale Stammzellen,13,26 pluripotente adulte Stammzellen,22,27 muskelresidente Seitenpopulationszellen,14 aus dem Knochenmark stammende Stammzellen,20,22 aus der Synovialmembran isolierte Stromazellen,21 aus der menschlichen Nabelschnur stammende Zellen,28 Perizyten15 und Meso-Angioblasten.29In dieser Studie bewerteten wir das Potenzial von aus Fett gewonnenen Stammzellen (ADSCs) als alternative Zellquelle für aus Gewebe hergestellte Skelettmuskeln, um die begrenzte Skalierungsfähigkeit von MDCs zu umgehen.ADSCs stellen eine reichlich vorhandene, leicht zu expandierende, pluripotente Stammzellquelle dar, die leicht aus Fettgewebe und stromavaskulärer Fraktion isoliert werden kann und im Vergleich zu aus Knochenmark stammenden MSCs in Bezug auf den einfachen Zugang vorteilhaft ist.30,31 Ähnlich wie aus Knochenmark stammende Es wurde auch gezeigt, dass MSCs, ADSCs, die aus Fettgewebe und Stromagefäßfraktionen stammen, in chondrogene, osteogene, adipogene und myogene Abstammungslinien differenzieren.30,31 Die vorhandene Literatur dokumentiert auch ihre Fähigkeit zur Differenzierung zu nichtmesenchymalen Abstammungslinien wie Neuronen32 und Hepatozyten.Darüber hinaus deuten Literaturhinweise darauf hin, dass lösliche Faktoren, die von myogenen Zellen sezerniert werden, ausreichen, um die Expression muskelspezifischer Proteine ​​in ADSCs zu fördern, die mit myogenen Zellen kokultiviert werden,33 und es wurde gezeigt, dass nicht kultivierte ADSCs ein intrinsisches myogenes Potenzial besitzen33, wenn auch mit sehr geringer Effizienz.Einige der oben genannten Zelltypen haben sich als vielversprechend erwiesen, wenn sie in verletzte Muskeln injiziert wurden;Keine dieser Studien untersuchte jedoch das Potenzial von ADSCs bei der Reparatur klinisch relevanter größerer Defekte, die VML-Verletzungen modellieren.Daher bildet diese Studie eine logische Erweiterung der Ergebnisse von Machingal et al.16 mit TEMR-Konstrukten, indem das Potenzial von TEMR-ADSC-Konstrukten für die Reparatur von VML-Verletzungen untersucht wird, die in einem murinen LD-Muskel entstanden sind.Alle Tiere wurden von kommerziellen Anbietern (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, USA) gekauft.Männliche Lewis-Ratten im Alter von 3–4 Wochen oder 8–10 Wochen wurden zur Isolierung von Spender-MDCs bzw. ADSCs verwendet.Weibliche athymische Nacktmäuse (nu/nu) im Alter von 8–10 Wochen wurden für In-vivo-Studien zur Reparatur von VML-Verletzungen verwendet.Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Wake Forest University genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit den Tierpflege- und Verwendungsrichtlinien der American Physiological Society durchgeführt.Isolierung von MDCs und ADSCsMDCs wurden aus den Musculus soleus und tibialis anterior von Spenderratten isoliert.Isoliertes Muskelgewebe wurde von zufälligem Gewebe und Sehnen befreit und in kleine Stücke zerkleinert.Zerhacktes Muskelgewebe wurde in 0,2 % Collagenase Typ I (Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ, USA) in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit niedrigem Glukosegehalt (Hyclone, Logan, UT, USA) für 2 Stunden bei 37°C inkubiert, gefolgt von einer Neutralisation mit Vollmedium, das DMEM mit niedrigem Glukosegehalt enthält, ergänzt mit 20 % fötalem Rinderserum (FBS) (Hyclone), 10 % Pferdeserum (Hyclone), 1 % Hühnerembryoextrakt (Accurate Chemical & Scientific Corporation, Westbury, NY, USA) und 1 % Penicillin/Streptomycin (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Verdaute Muskelfasern wurden in vollständigem myogenem Medium auf mit Matrigel TM (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) beschichtete Gewebekulturschalen ausplattiert.Matrigel wurde 1:50 in DMEM zum Beschichten von Gewebekulturplatten verdünnt.Die Zellen wurden bei 60 % Konfluenz passagiert, in Impfmedium kultiviert, das DMEM mit niedrigem Glucosegehalt, ergänzt mit 15 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin, enthielt, und zur Aussaat bei Passagen von nicht > 2 verwendet.ADSCs wurden gemäß den in der Literatur beschriebenen Protokollen isoliert.31,33 Kurz gesagt, Fettgewebe, das aus viszeralen oder subkutanen Regionen von Spenderratten gesammelt wurde, wurde ausgiebig mit DMEM mit niedrigem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % antibiotischer/antimykotischer Lösung (Thermo Fisher Scientific), gewaschen.Das gewaschene Gewebe wurde zerkleinert und mit 0,2 % Collagenase Typ I in DMEM bei 37°C für 1 Stunde unter konstantem Schütteln verdaut.Nach vollständiger Verdauung wurde die Fettgewebeaufschlämmung mit vollständigem Medium, bestehend aus DMEM mit niedrigem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Antibiotikum/Antimykotikum, neutralisiert und zentrifugiert, um die obere Fettschicht (bestehend aus reifen Adipozyten) von einem aus einer heterogenen Population bestehenden Pellet abzutrennen von Zellen einschließlich ADSCs.Pelletierte Zellen wurden resuspendiert und durch ein 100-μm-Zellsieb (BD Biosciences) filtriert und auf Gewebekulturschalen ausplattiert.BAM-Gerüste wurden wie zuvor beschrieben aus Schweineharnblase präpariert.34 Kurz gesagt, die Blasen wurden ausgiebig gewaschen, getrimmt und mikrodisseziert, um die Lamina-Propria-Schicht zu erhalten, und in 0,05 % Trypsin (Hyclone) für 1 Stunde bei 37 °C dezellularisiert.Dezellularisierte Blasen wurden dann über Nacht mit DMEM mit niedrigem Glucosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin, neutralisiert.Neutralisierte Blasen wurden durch Waschen mit 1 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) und Behandeln mit 0,1 % Ammoniumhydroxid (Sigma-Aldrich Co.) in deionisiertem Wasser für 3 Tage bei 4 weiter verarbeitet °C, gefolgt von einem abschließenden Waschen mit entionisiertem Wasser für 3 Tage bei 4 °C.Die strukturelle Zusammensetzung und das Fehlen zellulärer Elemente wurden durch histologische Beurteilungen bestätigt.Die dezellularisierte Lamina propria wurde weiter abgeschält, um eine dünne Urothelschicht aus BAM-Gerüst mit einer Dicke von 0,3–0,4 mm zu erhalten.Das vorbereitete BAM-Gerüst wurde in Streifen mit Abmessungen von 3 cm × 2 cm geschnitten und über vorgeschnittene Silikonformen medizinischer Qualität (McMaster-Carr, Atlanta, GA, USA) drapiert.Schließlich wurden Gerüste mit Silikonformen in einem Tisch-Gefriertrockner (Labconco, Kansas City, MO, USA) gefriergetrocknet und mit einem Ethylenoxid-Gassterilisator (Anderson Products, Haw River, NC, USA) sterilisiert und bei Raumtemperatur bis gelagert weitere Verwendung.Unmittelbar vor dem Aussäen der Zellen wurden die Gerüste mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 30 Minuten bei 37 °C vorgenässt, und dann wurden ADSCs oder MDCs mit 1 Million Zellen/cm2 Gerüstfläche ausgesät.Charakterisierung von Spenderzellen durch ImmunfluoreszenzanalyseIsolierte ADSCs und MDCs (in Passage 2) wurden auf das Vorhandensein von Standard-Zelloberflächenmarkern bzw. Kernmarkern charakterisiert, indem sie auf unbeschichteten Kammerobjektträgern oder Deckgläsern mit 4.000 Zellen/cm2 Fläche ausgesät und 3 Tage lang kultiviert wurden.MDC-besiedelte Deckgläser wurden mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS fixiert und mit 0,5 % Triton-X-100 permeabilisiert, während ADSC-besiedelte Deckgläser mit 4 % PFA in PBS fixiert, aber nicht permeabilisiert wurden, um Oberflächenmarker zu bewerten (CD73, CD90, CD34, CD45, CD31, Sca I), aber permeabilisiert, wenn auf das Fehlen muskelspezifischer Kernmarker (Pax7, MyoD und Myogenin) getestet wird.Fixierte und/oder permeabilisierte Deckgläser wurden mit 3 % Rinderserumalbumin in PBS für 30 Minuten blockiert und später mit in PBS verdünnten primären Antikörpern für 1 Stunde inkubiert (Tabelle 1).Anti-Maus-Sekundärantikörper, die entweder in Ziege oder Pferd hergestellt und mit einem Texas-Rot-Fluorophor konjugiert wurden, wurden 1:200 in PBS verdünnt und mit primär markierten Deckgläsern für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.Fluoreszenzmikroskopische Bilder wurden mit einem Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, NY, USA) oder einem DM4000B Leica Aufrechtmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) erhalten.Tabelle 1 Oberflächen- und Kernmarkerexpression in kultivierten ADSCs und MDCs Anmerkungen: Quellenangaben: BD Biosciences (San Jose, CA, USA);Novus Biologicals (Littleton, CO, USA);Abcam (Cambridge, Großbritannien);DHSB (Iowa City, IA, USA);Dako Denmark A/S (Glostrup, Dänemark).Abkürzungen: CD, Differenzierungscluster;ScaI, Stammzellantigen I;IgG, Immunglobulin G;10, primärer Antikörper;ADSCs, aus Fett stammende Stammzellen;MDCs, Muskel-abgeleitete Vorläuferzellen;FACS, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung;IF, Immunfluoreszenz;NT, nicht getestet;+ve, positiv;−ve, negativ.Charakterisierung von Spenderzellen durch fluoreszenzaktivierte ZellsortierungADSCs oder MDCs (Passage 2) wurden für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)-Analyse vorbereitet, indem sie bei 1 Million Zellen/100 &mgr;l in Blockierungspuffer (10 % FBS in PBS) resuspendiert wurden.Für die Oberflächenmarkeranalyse wurden ADSCs mit primären Antikörpern (1:10, Verdünnung in 100 μl Blockierungspuffer) für 30 Minuten inkubiert (Tabelle 1) und dann zweimal mit 10 % Natriumazid in Blockierungspuffer gewaschen.Die Zellen wurden dann mit Anti-Maus-Sekundärantikörpern inkubiert, die entweder in Ziege oder Pferd hergestellt und an ein Fluoresceinisothiocyanat-Fluorophor für 30 Minuten konjugiert wurden, zweimal in Blockierungspuffer gewaschen und unter Verwendung von 2 % PFA in Blockierungspuffer für 15 Minuten nachfixiert.Für die Kernmarkeranalyse wurden ADSCs und MDCs durch Fixieren mit 2 % PFA in Blockierungspuffer hergestellt und dann mit Permeabilisierungspuffer, bestehend aus 0,2 % Rinderserumalbumin + 0,15 % Triton-X-100 in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, permeabilisiert.Die Zellen wurden dann mit primären Antikörpern (Tabelle 1) für 1 Stunde inkubiert und gefolgt von zweimaligem Waschen mit Blockpuffer und Inkubation mit sekundären Anti-Maus-Antikörpern, die entweder in Ziege oder Pferd hergestellt und mit Fluoresceinisothiocyanat-Fluorophor für 30 Minuten konjugiert wurden.Präparierte Zellen wurden mit einem BD FACSCalibur-Durchflusszytometer (BD Biosciences) unter Verwendung eines 488-nm-Lasers erfasst und mit der CellQuest Pro-Software Version 3.3 (BD ​​Biosciences) analysiert.TEMR-Konstrukte wurden erstellt, indem entweder MDCs (TEMR–MDCs) oder ADSCs (TEMR–ADSCs) auf BAM-Gerüsten ausgesät wurden.Während MDC-besiedelte BAM-Gerüste wie zuvor beschrieben16 vor der Implantation eine In-vitro-Differenzierung und Reifung in Bioreaktoren durchliefen, wurden ADSC-besiedelte BAM-Gerüste 3 Tage lang in ADSC-Proliferationsmedien gehalten, aber vor der Implantation keinen Differenzierungsprotokollen unterzogen.Beide Seiten des Gerüsts wurden mit Zellen besät, indem die Gerüste einen Tag nach der anfänglichen Besiedelung umgedreht wurden.Die getesteten experimentellen Gruppen umfassten R-TEMR-ADSCs (n=13), R-TEMR-MDCs (n=10), nur Gerüst (RS, n=8), Verletzung, aber keine Reparatur (NR, n=7) und unverletzte native LD-Muskeln.Chirurgische Erzeugung einer VML-Verletzung und Implantation eines TEMR-KonstruktsDie chirurgische Erzeugung der murinen VML-Verletzung und die Implantation von TEMR-Konstrukten aus experimentellen Gruppen wurden wie zuvor berichtet durchgeführt eine zuvor beschriebene Methodik.16 Kurz gesagt, wurde ein Längsschnitt entlang der Mittellinie des Rückens vorgenommen.Der Trapezmuskel, der den LD-Muskel bedeckt, wurde angehoben, um den LD-Muskel freizulegen, ohne die am Oberarmknochen eingeführte Sehne zu entfernen.Dann wurden Nahtmarkierungen auf dem LD-Muskel platziert, die die obere Hälfte der Spinalfaszie und die mediale Hälfte des Muskelkopfes am Humerus abgrenzten.Die mediale Hälfte des Muskels wurde dann unter Verwendung einer feinen Schere exzidiert.Mit dieser Methode wurde ein Defekt mit einem Gewicht von 16–20 mg aus dem LD-Muskel herausgeschnitten.Nach der chirurgischen Exzision wurden den Mäusen entweder R-TEMR-ADSCs oder R-TEMR-MDCs-Konstrukte implantiert.Nur Gerüst (RS), Verletzung, aber keine Reparatur (NR) und unverletzte native LD-Muskeln bildeten andere Gruppen.Die TEMR-Konstrukte wurden am verbleibenden LD-Muskel an der Verletzungsstelle unter Verwendung von Vicryl 6-0-Nähten angenäht.In allen Fällen wurden die Fascia und die Haut dann zugenäht und die Tiere konnten sich von der Anästhesie erholen.Die Tiere wurden geopfert, und durch Gewebezüchtung hergestellte LD-Muskeln (bestehend aus verbleibenden nativen Muskel- und TEMR-Konstrukten) wurden 2 Monate nach der Implantation zur histologischen Bewertung entnommen.Wiedergewonnene LD-Muskeln wurden für die Paraffin-Einbettung unter Verwendung von Standardverfahren verarbeitet.Kurz gesagt, LD-Muskeln wurden in 10 % neutral gepuffertem Formalin (10 × Gewebevolumen) über Nacht fixiert, in 60 % Ethanollösung überführt und anschließend in einem ASP300S Paraffin-Gewebeprozessor (Leica Microsystems) verarbeitet und in Paraffinblöcke in Gewebeeinbettungskassetten (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA).Massons Trichromfärbung und immunhistochemische (IHC) Färbungen wurden an 7–10 μm dicken seriellen Schnitten durchgeführt, die aus den in Paraffin eingebetteten Blöcken auf einem Leica RM 2135 Mikrotom (Leica Microsystems) geschnitten wurden.IHC-Färbungen wurden unter Verwendung von Antikörpern zum Nachweis von Myosin (MF-20, 1:10), Titin (9D10, 1:10), Ryanodinrezeptor 1 (RyR1; 34C, 1:10) und Junctophilin 1 (Jp1; Thermo Fisher Scientific 40-5100, 1:120).MF-20-, Titin- und RyR1-Antikörper wurden von der Developmental Studies Hybridoma Bank erworben, die vom National Institute of Child Health and Human Development der National Institutes of Health gegründet und an der University of Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA, unterhalten wird , VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA.Alle übrigen Reagenzien und sekundären Antikörper, die für die IHC-Färbung verwendet wurden, wurden von Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA, bezogen.Biotinylierter Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper (MKB-2225, 1:250) oder Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (BA-1000, 1:500) wurde verwendet, um Maus (MF-20, 9D10 und RyR1) oder Kaninchen (Jp1 ) primäre Antikörper.Die Farbentwicklung erfolgte durch Behandlung der Antikörper-markierten Schnitte mit Avidin-Biotin-Komplex-Reagenz (PK-7100) und anschließender Visualisierung unter Verwendung des ImmPACT™ NovaRED™-Substratkits (SK-4800).Schließlich wurden die Schnitte unter Verwendung von Gill's Hämatoxylin (GHS280; Sigma-Aldrich Co.) gegengefärbt.Die Bilder wurden mit dem DM4000B Leica Upright Microscope (Leica Microsystems), das mit einer QICAM-Digitalkamera (QImaging, Surrey, BC, Kanada) ausgestattet war, bei verschiedenen Vergrößerungen aufgenommen und digitalisiert.Nachweis von Spenderzellen durch ImmunhistochemieLentivirus-exprimierender Cherry-Reporter wurde vor der Aussaat auf BAM-Gerüste entweder in MDCs oder ADSCs transduziert.TEMR-lenti-Cherry-MDC/ADSC-Konstrukte wurden an der Stelle der chirurgischen Reparatur implantiert, und konstruierte Muskeln wurden 2 Monate nach der Reparatur entnommen und für die Einbettung in Paraffin verarbeitet.IHC-Färbung wurde an Schnitten mit Anti-Cherry-Antikörper (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) durchgeführt.Charakterisierung von ADSCs und MDCsAus Spenderratten isolierte ADSCs (Passage 2) wurden durch Immunfluoreszenzmikroskopie und FACS-Analyse auf das Vorhandensein von positiven und negativen Standardmarkern charakterisiert (Abbildung 1).Aus der FACS-Analyse war ersichtlich, dass ADSCs die Standard-Oberflächenmarker CD73 und CD90 exprimierten, aber nicht CD34, CD31, CD45 (Daten nicht gezeigt) und ScaI exprimierten, was die relative Reinheit von isolierten ADSCs bestätigte.ADSCs exprimierten auch nicht die standardmäßigen Kernmuskelmarker Pax7 (Daten nicht gezeigt), MyoD und Myogenin, was eine Präkontamination von ADSCs mit Muskelvorläuferzellen ausschließt.Die FACS-Analyse schätzte den Prozentsatz von CD73- und CD90-Zellen auf 89,42 % ± 2,4 % bzw. 92,80 % ± 2 %.1H zeigt den Durchschnitt der CD73- und CD90-Prozentsätze aus drei getrennten Experimenten.Die Charakterisierung von MDCs zeigte eine heterogene Zellpopulation, die Satellitenzellen (Stammzellen, Pax7 +ve [16,36 % ± 4 %)), Vorläuferzellen (MyoD + ve, 31,32 % ± 4 %) und differenzierungsgebundene Zellen (Myogenin + ve, 20,91 % ± 2 %) und umfasst somit im Wesentlichen Zellen in verschiedenen Entwicklungsstadien des Zellzyklus (Tabelle 1).Abbildung 1 Charakterisierung von aus Rattenfett stammenden Stammzellen (ADSCs) in Kultur.Hinweise: ADSCs wurden nach der Isolierung kultiviert und die Zellen in Passage 2 wurden entweder auf Glasdeckgläschen ausgesät und 3 Tage lang in einem undifferenzierten Zustand in Proliferationsmedien kultiviert oder für die FACS-Analyse verarbeitet.Die Expression von Standard-Oberflächenmarkern für ADSCs wurde durch Färbung von CD73 (A) und CD90 (B) bestätigt.C und D zeigen den Prozentsatz von CD73- und CD90-Zellen durch FACS-Analyse.Das Fehlen jeglicher kontaminierender Muskelvorläuferzellen in ADSC-Kulturen wurde durch das Fehlen einer IF-Färbung für Kernmuskelmarker MyoD (E), Myogenin (F) und einen unspezifischen ADSC-Oberflächenmarker Sca I (G) gezeigt.Die FACS-Analyse (n = 3) schätzte, dass 89,42 % ± 3,2 % der Zellen CD73 exprimierten, während CD90 von 92,80 % ± 2,4 % der Zellen exprimiert wurde (H).Die FACS-Analyse bestätigte auch die negative Färbung von Muskelmarkern (Pax7, MyoD und Myogenin) und das Fehlen von unspezifischen Oberflächenmarkern (Sca I) in ADSCs.M1 stellt das Gate dar, das verwendet wird, um die positive Zellpopulation zu definieren.Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt.Abkürzungen: FACS, Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung;FITC, Fluoresceinisothiocyanat;DAPI, 4', 6-Diamidino-2-phenylindol.Histologische Charakterisierung von TEMR-Konstrukt-reparierten Muskeln und Beweis für NeogewebebildungBei VML-Verletzungen, die mit TEMR-MDC- (Abbildung 2) oder TEMR-ADSC-Konstrukten (Abbildung 3) repariert wurden, wurden die grobe Morphologie und die qualitative Bewertung der Neogewebebildung und des Umfangs des Gerüstumbaus 2 Monate nach der Reparatur durch Masson-Trichrom-Färbung bewertet.Abbildung 2A zeigt die Schnittstelle des abgerufenen konstruierten Muskels, der mit TEMR-MDC-Konstrukten repariert wurde.Die VML-Verletzungsreparatur mit TEMR-MDC-Konstrukten wies typische Kennzeichen für die Bildung von Neogewebe auf, wie die Fusion von Myoblasten (Abbildung 2D), die Bildung differenzierter länglicher Fasern (Abbildung 2C) und kleinere reife gestreifte Myofasern (Abbildung 2B) auf dem Gerüstteil des konstruierten Muskel, der an die In-vitro-Differenzierung von Skelettmuskelzellen erinnert.Diese Beobachtungen liefern überzeugende Beweise für die Bildung von neuem Gewebe in TEMR-MDC-Konstrukten.VML-Verletzungsreparaturen mit TEMR-ADSC-Konstrukten zeigten in ähnlicher Weise ein robustes Regenerationspotenzial, wie durch die Umgestaltung des Gerüsts (Pfeile in Abbildung 3A und C) und die offensichtliche Regeneration neuer Muskelfasern (Pfeile in Abbildung 3B und D) angezeigt.Die entstehenden Muskelfasern sind im Vergleich zu nativen Muskelfasern relativ dünn und kurz (Abbildung 3B).Das Vorhandensein von Blutgefäßen ist in Abbildung 3D mit # markiert, was das Vorhandensein von Gefäßelementen anzeigt.Abbildung 2 Nachweis für neue Gewebebildung bei VML-Verletzungen, die mit TEMR-MDC-Konstrukten repariert wurden.Anmerkungen: LD-Muskeln, die mit TEMR-MDC-Konstrukten (n = 10) repariert wurden, wurden 2 Monate nach der Implantation entnommen, in Paraffin eingebettet und für die Masson-Trichrom-Färbung verarbeitet und auf Morphologie und neue Gewebebildung analysiert.Rot zeigt Muskeln an, Blau zeigt Kollagen an und Schwarz zeigt Zellkerne in der Masson-Trichrom-Färbung an.(A) Ein Überblick an der Schnittstelle von nativem Gewebe und Gerüst.(B) Pfeile zeigen quergestreifte Muskelfasern an, die sich regenerieren.(C) Pfeile zeigen lange, differenzierte MDCs und Neofasern auf dem Gerüst an, während Pfeile in (D) die Fusion von MDCs anzeigen, um neue Muskelfasern zu bilden.Abkürzungen: VML, volumetrischer Muskelverlust;TEMR, Tissue-Engineering-Muskelreparatur;MDC, Muskel-abgeleitete Vorläuferzelle;LD, großer Rücken.Abbildung 3 Nachweis für neue Gewebebildung bei VML-Verletzungen, die mit TEMR-ADSC-Konstrukten repariert wurden.Anmerkungen: LD-Muskeln, die mit TEMR-ADSC-Konstrukten (n = 13) repariert wurden, wurden 2 Monate nach der Implantation entnommen und durch Masson-Trichrom-Färbung auf in Paraffin eingebetteten histologischen Schnitten auf Morphologie und neue Gewebebildung analysiert.Rot zeigt Muskeln an, Blau zeigt Kollagen an und Schwarz zeigt Zellkerne in der Masson-Trichrom-Färbung an.Die Bildung von Neogewebe nach Reparatur mit TEMR-ADSC-Konstrukten wird in zwei repräsentativen Tieren gezeigt.A und C zeigen einen Überblick über das native Gewebe und Gerüst und B und D zeigen eine vergrößerte Ansicht auf der konstruierten Seite des Gerüsts in zwei repräsentativen Tieren.Die Bildung von Neo-Gewebe ist aus Anzeichen von Fusion, Umbau des Gerüsts und Faserbildung auf dem Gerüstteil des konstruierten Muskels ersichtlich.Pfeile zeigen den Umbau des Gerüsts (A und C) oder die Regeneration von Muskelfasern (B und D) an;# zeigt das Vorhandensein von Gefäßstrukturen (Blutgefäßen) an.Abkürzungen: VML, volumetrischer Muskelverlust;TEMR, Tissue-Engineering-Muskelreparatur;ADSC, aus Fett stammende Stammzellen;LD, großer Rücken.Immunhistologische Färbungen wurden an Gewebeschnitten von Paraffin-eingebetteten gewonnenen Gewebezüchtungsmuskeln durchgeführt, die mit TEMR-ADSC-Konstrukten repariert wurden.Abbildung 4 zeigt IHC-Färbungen an der Schnittstelle von nativem Muskel und TEMR-Konstrukt.Eine positive Färbung für die schwere Myosinkette (MF20-Antikörper) in einem sarkomeren Muster wurde nachgewiesen, wie in 4A angegeben.In ähnlicher Weise wurde in Abbildung 4B eine positive Färbung für das sarkomere Protein Titin (Antikörper 9D10) nachgewiesen.Ebenso wurde das Vorhandensein von Junctophilin 1 (Jp1) und Ryanodinrezeptoren (RyR1), zwei Proteinen, die an der Anregungs-Kontraktions-Kopplung beteiligt sind, in Abbildung 4C und D an der Grenzfläche und innerhalb des Gerüsts ähnlich wie bei nativen Muskeln nachgewiesen.Abbildung 4 TEMR-ADSC-Konstrukt-reparierte LD-Muskeln weisen strukturelle und funktionelle Kennzeichen auf, die an native Muskeln erinnern.Anmerkungen: Mit TEMR-ADSC-Konstrukten reparierte LD-Muskeln wurden 2 Monate nach der Implantation entnommen und durch IHC-Färbung auf in Paraffin eingebetteten histologischen Schnitten auf Morphologie und neue Gewebebildung analysiert.Die IHC-Färbung zeigte Positivität für Strukturproteine, die schwere Kette von Myosin (MF20; A) und Titin (9D10; B).In ähnlicher Weise zeigte die IHC-Färbung das Vorhandensein funktioneller Proteine, Junctophilin (Jp1; C) und Ryanodinrezeptor 1 (RyR1; D).Abkürzungen: TEMR, Tissue-Engineered Muscle Repair;ADSC, aus Fett stammende Stammzellen;LD, großer Rückenmuskel;IHC, Immunhistochemie.Nachweis für das Vorhandensein vaskulärer Elemente in TEMR-ADSC-reparierten KonstruktenLD-Muskeln, die mit TEMR-ADSC-Konstrukten repariert wurden, wurden 2 Monate nach der Implantation entnommen und auf das Vorhandensein von Gefäßstrukturen analysiert.Abbildung 5A und B zeigen die Schnittstelle des nativen LD-Muskels und der Gerüstseite, die mit ADSCs bei geringerer bzw. höherer Vergrößerung ausgesät wurde.Eine positive Färbung für den von-Willebrand-Faktor, der Blutgefäße färbt, bestätigt die Entwicklung von Gefäßelementen auf der Gerüstseite des gentechnisch veränderten Gewebes, was auf das Potenzial für ein langfristiges Überleben von Neogewebe und Integration mit Wirtsgewebe hinweist.Abbildung 5 Nachweis für das Vorhandensein von vaskulären Elementen auf der Gerüstseite in wiedergewonnenen technisch hergestellten Muskeln, die mit TEMR-ADSC-Konstrukten repariert wurden.Anmerkungen: Mit TEMR-ADSC-Konstrukten reparierte LD-Muskeln wurden 2 Monate nach der Implantation entnommen und auf das Vorhandensein von Gefäßstrukturen analysiert.Die Schnittstelle von nativem LD-Muskel und Gerüstseite, die mit ADSCs bei geringerer Vergrößerung (A) und höherer Vergrößerung (B) ausgesät ist.Eine positive Färbung für von Willebrand-Faktor (vWF) von Blutgefäßen bestätigt die Entwicklung von Gefäßelementen auf der Gerüstseite des konstruierten Gewebes.Abkürzungen: TEMR, Tissue-Engineered Muscle Repair;ADSC, aus Fett stammende Stammzellen;LD, großer Rücken.Überleben von Spenderzellen und Beitrag zur Bildung von neuem MuskelgewebeDas Überleben der Spenderzellen nach der Implantation von TEMR-MDC- und TEMR-ADSC-Konstrukten wurde 2 Monate nach der Reparatur von gewonnenen technisch hergestellten Muskeln analysiert (Abbildungen 6 und 7).Lentivirus-exprimierender Cherry-Reporter wurde vor der Aussaat auf BAM-Gerüste entweder in MDCs oder ADSCs transduziert.TEMR-lenti-Cherry-MDC/ADSC-Konstrukte wurden an der Stelle der chirurgischen Reparatur implantiert, und konstruierte Muskeln wurden 2 Monate nach der Reparatur entnommen und für die Paraffineinbettung verarbeitet.IHC-Färbung wurde an Schnitten mit Anti-Cherry-Antikörper durchgeführt (Abbildungen 6 und 7).Negative Kontrollen aus angrenzenden Schnitten wurden angezeigt, um die Spezifität der Färbung mit Anti-Cherry-Antikörper zu bestätigen (Figuren 6D und 7B und D).Neu regenerierende, differenzierende und verlängerte Muskelfasern, die Spender-MDCs enthalten, konnten an der Schnittstelle in Abbildung 6A, B und C nachgewiesen werden (in Abbildung 6C durch Pfeile gekennzeichnet).Das Gerüst zeigte auch unfusionierte Spender-MDCs (angezeigt durch weiße Pfeile in Abbildung 6B).In ähnlicher Weise zeigten TEMR-ADSC-reparierte Muskelkonstrukte auch hybride Muskelfasern, die Spender-ADSCs enthielten (Abbildung 7A), aber ihr Auftreten war im Vergleich zu TEMR-MDC-Konstrukten relativ gering.Ein großer Teil des Gerüsts zeigte jedoch unfusionierte Spender-ADSCs (Abbildung 7C).Interessanterweise wurden auch nicht verschmolzene Spender-ADSCs um mutmaßliche neue Blutgefäße herum entdeckt (Strukturen, die in Abbildung 7C durch schwarze Pfeile gekennzeichnet sind), was darauf hinweist, dass ADSCs potenziell teilnehmen oder die Vaskularisierung verstärken können.Abbildung 6 Identifizierung von Spender-MDCs in wiederhergestellten technisch hergestellten Muskeln, die mit TEMR-MDC-Konstrukten repariert wurden.Anmerkungen: Lentivirus-exprimierende Cherry-Reporter wurden in MDCs transduziert, bevor sie auf BAM-Gerüste ausgesät wurden.TEMR-lenti-Cherry-MDC (n=8)-implantierte konstruierte Muskeln wurden 2 Monate nach der Reparatur entfernt und für die Paraffin-Einbettung verarbeitet.An Schnitten mit Anti-Cherry-Antikörper wurde eine immunhistochemische (IHC) Färbung durchgeführt.A zeigt einen Überblick über die IHC-Kirsch-positive Färbung an der Grenzfläche (gekennzeichnet durch blaue Pfeile) von nativem Gewebe und Gerüst.Neu regenerierende, differenzierende und verlängerte Muskelfasern, die Spender-MDCs enthalten, konnten bei niedriger (A) oder hoher Vergrößerung (B und C) nachgewiesen werden, angezeigt durch schwarze Pfeile;Gerüst zeigte auch unfusionierte Donor-MDCs, wie durch weiße Pfeile (B) angezeigt.Negativkontrollen (D) aus angrenzenden Schnitten wurden angezeigt, um die Spezifität der Anti-Cherry-Antikörperfärbung zu bestätigen.IHC-Cherry –ve, Negativkontrolle, erfolgt durch Weglassen des primären (Cherry) Antikörpers;IHC-Cherry +ve, positive Färbung, erhalten bei Verwendung von primärem (Cherry) Antikörper.Alle Rechte vorbehalten.